第15章 基因工程导论_图文

发布于:2021-05-14 02:53:41

第十九章 基因工程导论
本章学时数:3-4学时 本章重点:1.基因工程原理和方法 2.转基因技术及应用

遗传工程
广义的遗传工程
指的是用遗传学手段来改造或重组生物的遗 传特性的技术,包括杂交、细胞工程、染色 体工程、蛋白质工程和基因工程等。

狭义的遗传工程
仅指基因工程。

基因工程
Gene engineering 指用类似工程设计的方法,人为地在体 外将核酸分子插入质粒、病毒或其他载 体中,构成遗传物质的新组合,并将它 转移到原先没有这类分子的寄主细胞中 扩增和表达。 DNA重组技术是基因工程的基础。

重组DNA技术
Recombinant DNA technology,1972年, Berg发明。 定义:指在体外将不同来源的DNA进行剪切和重组,
形成嵌合DNA分子,通过载体系统,将之导入宿主 细胞,使其扩增表达从而使宿主细胞获得新的遗 传性状。

步骤:1. 分离制备目的基因或特定的DNA片段
2. 目的基因与载体连接,构建重组DNA分子 3.重组DNA分子引入宿主并扩增表达。

质粒DNA

细胞

D N A 重 组 技 术

————提取————

————酶切————

连接,形成嵌合质粒

在大肠杆菌中扩增

基因工程的基本内容和技术
基因工程的核心技术是分子克隆 主要内容:
? ? ? ? ?

从复杂生物体基因组中,分离带有目的基因的DNA片段 或用化学方法合成基因。 将目的DNA片段与能够自我复制并具有选择标记的载体 分子在体外连接,形成重组DNA分子 将重组的DNA分子引入到适宜的受体细胞中进行扩增 从繁殖的大量细胞群体中筛选和鉴定,以获得重组DNA 分子的受体细胞的克隆 从所筛选的受体细胞克隆提取已扩增的目的基因后, 或再将其克隆到表达载体上,导入寄主细胞,以便在 新的背景下实现功能表达,生产人们所需的物质,或 将已扩增的目的基因作进一步的分析研究。

基因工程的基本技术
核酸研究技术
? ?

?
?

核酸提取技术 核酸鉴定技术 核酸测序技术 核酸人工合成技术等

培养技术
? ?

微生物培养技术 动植物细胞培养技术

转化技术 筛选技术等等

限制性核酸内切酶
限制性内切核酸酶restriction endonuclease, 简称限制酶restriction enzyme
?

可识别DNA链的特定碱基顺序并在特定位置将DNA 链切断,形成*切或错切端口的水解酶。 通常用细菌学名(属名和种名)、菌株名、特征 和发现的顺序缩写表示。如EcoRI是从含R质粒的 大肠杆菌中分离的第一个限制性内切酶。

限制酶的命名规则:
?

三类限制酶的主要特性
限制酶的共性:只降解双链DNA分子; 各有特定的核苷酸序列识别特异性;酶 活性需要镁离子的激活 根据结构、切割位点和识别序列间的 距离不同和酶激活所需辅助因子的差异 等,可以将限制酶分为三类

特性

I 型酶

II 型

III 型酶

限制和修饰活性
蛋白质结构 辅助因子 寄主特异性位点序列 切割位点

3亚基多功能酶
3种不同的亚基 ATP、Mg2+等 EcoB:TGANTGCT 距特异性位点至少 1000bp

单一
单一的成分 Mg2+ 旋转对称 位于特异性位点

2亚基双功能酶
2种不同的亚基 ATP、Mg2+等 EcoP1:AGACC 距特异性位点25bp 左右

DNA易位作用
甲基化作用的位点 序列特异性切割 在DNA克隆中的用途


寄主特异性的位点 不是 无用

不能
寄主特异性的位点 是 十分有用

不能
寄主特异性的位点 是 有用

II型限制酶的基本性质

R=A 或 G Y=C 或 T M=A 或 C K=G 或 T S=C 或 G W=A 或 T H=A 或 C 或 T B=C 或 G 或 T V=A 或 C 或 G D=A 或 G 或 T N=A 或 C 或 G 或 T

修饰酶
修饰酶
内切酶对自身的DNA也有可能的破坏。 ? 修饰酶识别特定的顺序并将其甲基化,保护 不被限制性内切酶作用。
?

DNA的限制酶分析和物理图谱

DNA连接酶
DNA连接酶(ligase)是一种能够催化DNA中相 邻的3’-OH和5’-磷酸基末端之间形成磷酸二 酯键并把两段DNA拼接起来的核酸酶。 连接酶催化反应的最适温度是37℃。 连接酶把两个具有粘性末端的DNA分子连接在 一起的方式称作“粘接”,而使*末端的双链 DNA分子彼此连接的方式则称为“端接”。连 接酶也用于连接化学合成的衔接物(linker), 这有助于体外合成人造基因。

反转录酶
反转录酶(reverse transcriptase,RT)是一 类很独特的DNA聚合酶,以RNA为模板来指 导DNA的合成。 1970年首先在RNA病毒中发现,由反转录病 毒的pol基因编码。 现在常用的反转录酶由?和?两条多肽链组成, ?肽链的羧基端具有反转录酶活性,而氨基端 有RNaseH活性; ?肽链具有以RNA-DNA杂 种分子为底物的5‘?3’脱氧核酸外切酶活性。

反转录酶的应用
以mRNA为模 板合成cDNA
克隆基因 ? 制备探针
?

目的基因的分离或制备
人工合成目的基因
?

当RNA的碱基顺序或蛋白质的氨基酸顺序已知时,用特定 的仪器进行合成。 富含G/C对的基因 加热后用SI核酸酶切除单链,离心得到双链片段。 易得到mRNA的基因 用polyT柱分离mRNA,在反转录酶作用下合成cDNA,除 去RNA,用DNA聚合酶下合成双链。 并非严格意义上的基因。 PCR扩增 进化中DNA保守性很强,不同生物同一功能基 因的顺序大部分相同,设计引物PCR扩增。

目的基因分离
?

?

?

目 的 基 因 的 获 得

PCR扩增获得目的基因
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez ?db=Nucleotide

载体 vector
分子克隆的载体应具备的条件:
在细菌中增殖,可以在菌株间传递,也可以 转化菌株。 ? 含有酶切位点,最好是对多种限制酶都有单 一切点,切点不在复制原点内。 ? 含有抗性基因(具备对重组体容易检测的选 择性遗传标记)。 ? 其他
?

包括质粒、噬菌体和病毒

载体 vector
分类:
克隆载体,以繁殖DNA片段为目的的载体。 如pBR322及其衍生质粒。 ? 穿梭载体,既能在真核细胞中复制又能在原 核细胞中复制的载体。
? ?

表达载体,用于使克隆的外源基因在宿主细 胞内表达的载体。需要有强启动子和终止子; 转录在诱导时进行,产生的mRNA具有 AUG和SD。

构 建 重 组 D N A

质粒载体
基本性质
共价闭合的环状双链DNA分子,大小从1kb 到200kb不等,常带有特殊的基因。 ? 含有复制子,可独立复制但依赖宿主的酶系 ? 松弛型复制质粒和严紧型复制质粒 ? 具有转移特性,接合型质粒(自主转移质粒) 和非接合型质粒 ? 具有不相容性
?

质粒载体的构建
早期用天然质粒,有局限性 改造
改变大小 ? 引入适当的选择标记 ? 改变限制酶的切割位置 ? 增加合适的酶切位点
?

pBR322的结构
4362kb 有HindIII、 BamHI、Sal I、 Pvu II、Cal I、 AvaI和EcoR1 单一切点 有Ampr和Tetr基 因

pBR322的构建

噬菌体载体
λ噬菌体是迄今为止研究得最为详尽的一 种大肠杆菌双链DNA噬菌体。它的DNA 分子两端各有由12个核苷酸组成的粘性 末端,两者互补可形成COS位点 (cohesive end site)。

柯斯质粒载体
柯斯质粒(cosmid)是人工构建的带有粘性末端 cos的一类质粒,其主要组成有质粒的复制起 始区和抗药标记、一种或多种限制酶的单一切 点以及λDNA的COS区小片段(约20至数百个 碱基对)。 因而这类质粒兼具λ噬菌体和质粒的优越性, 又具有高容量的克隆能力,容纳外源DNA的长 度可达45 kb左右。

单链DNA噬菌体载体

真核基因克隆的载体
植物
用于植物基因转移的病毒载体 ? 质粒载体
?

动物
病毒载体 ? 人工染色体
?

用于植物基因转移的病毒载体

多种植物病毒经过改造后可用作载体。

质粒载体
Ti 和Ri等

动物病毒载体

改造后失去毒性的动物病毒

人工染色体
artificial chromosome ? 一些真核基因过于庞大不能作为单一片段克 隆到噬菌体载体或质粒中 ? P1噬菌体人工染色体 (p1artificial chromosome,PAC) ? 细菌人工染色体 (bacterial artificial chromosome,BAC) ? 酵母人工染色体 (yeast artificial chromosome,YAC)

酵母人工染色体YAC
以酵母作为构建人工染色体的材料,是由于其 基因组很小,约为1~14mb,且其中极少内含 子,没有重复序列和假基因。其基因行为和表 达方式基本上与高等生物类似,如复制、重组、 染色体分离等等,因而是研究真核生物分子遗 传学的重要实验模型。 *年对有关酵母染色体的主要组分:着丝粒、 自主复制序列 (autonomously replicating sequence,ARS) 及端粒的研究又较清楚,并被分离和克隆出来, 其功能区已缩小到数百碱基对,这些对研究高 等生物染色体的结构与功能也是极为有利的。

基因组克隆
用限制性内切酶切割整个基因组DNA, 把所得的大量基因组DNA片段与载体连 接,然后转化到细菌中去,让宿主菌长 成克隆。由此而得的克隆中每个细胞的 载体上都包含有特定的基因组DNA片段。 这样的一套克隆便称作基因组克隆,而 这些克隆中的一套基因组DNA片段则叫 做基因组文库(genomic library)。

基因组文库 genome library
将某种生物的基因组DNA用限制性内切 酶切割后分别与载体组合构建一系列重 组质粒,转移到细菌中,通过细菌增殖 保存基因片段,形成多个基因克隆。 在得到的克隆数目多到可以把该生物的 全部遗传信息都包含在内时,这些克隆 的总体就称为基因组文库。

基因文库

cDNA文库的构建和应用
cDNA基因文库(cDNA library)是指以 mRNA为模板, 在反转录酶及其他一系列酶的催化作用下所获得的双 链cDNA,经与适当载体连接并转化到寄主细胞内进 行扩增,由此而构成包含着相应基因编码序列的一群 克隆。 与基因组DNA克隆不同,用作cDNA克隆的真核 mRNA,其间隔序列早已在拼接过程中被删除,而由 这种成熟mRNA为模板转变而来的DNA基因,自然也 不含有非编码序列。 cDNA克隆除以 mRNA为起始材料这一优点外,其构 建比较简易可行,而且由于每一个cDNA克隆都只含 有一种mRNA序列,这样在选择中出现假阳性的概率 也就较低

基因工程技 术的应用

基因工程技术的应用
生物合成 基因结构与定位 RFLP 基因治疗 环境治理 分子标记

生物合成
目的基因在细菌中的表达,产生人们需 要的蛋白质。 1977,Boyer将编码人体脑激素的基因转 移到大肠杆菌中,使细菌合成了人体生 长激素释放抑制因子。 发酵法生产的成本得到大大降低

植物基因工程与农作物育种

动物基因工程与畜禽品种改良
借助基因工程技术把外源目的基因导入 生殖细胞、胚胎干细胞和早期胚胎,并 在受体染色体上稳定整合,使之经过各 种发育途径得到能把外源目的基因传给 子代的个体,即转基因动物 (transgenic animal)。

基因工程技术与医学研究

基因治疗
1990年,首例基因治疗 将有功能的基因插入病毒 基因组中,感染体外培养 的淋巴细胞,筛选转基因 表达细胞进行扩增,然后 注回患者体内,可以保持 一段时间的效果,达到目 的。

转基因技术及应用

农杆菌介导法
根癌农杆菌含有致瘤质粒(Ti质 粒),在T-DNA区有反向重复 顺序,可以与宿主相应区域发 生重组整合。 步骤: 1.构建重组Ti质粒,导入农杆菌

2.农杆菌与受体植物共培养
3.筛选转化后代 4.分子检测

其他转化方法
植物病毒介导法 种质系统介导法
花粉管通道法 ? 生殖细胞浸泡法 ? 子房注射法 ? ……
?

其他转化方法
物理的方法
电激法 ? 基因枪法 ? 超声波法 ? 激光微束法 ? 显微注射法
?

化学的方法
PEG法 ? 脂质体介导法
?

动物转基因技术及应用
1.受精卵原核显微注射法 2.胚胎干细胞介导法 3.反转录病毒转移基因

基因分离新技术
转座子标签技术
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转座子插入引起突变,表明插入位点的基因 发生变化。tagging

基因组消减技术 基因敲除技术

分子标记
又称遗传标记(genetic marker),指可以 追踪染色体、染色体的某一片段、某个基因 或某一特定DNA序列在家系中传递轨迹的任 何一种遗传特性。 包括:
RFLPs ? RAPD ? AFLP ? SNP ? VNTR、STS、EST……
?

限制性片段长度多态性RFLP
Restrict fragment length polymerphism 进化过程中碱基突变导致酶切位点变化, 从而产生限制性片段(RF)在长度和多 少上的差异,反映了不同个体在DNA上 的差异。 RF以共显性方式遗传,没有表型效应, 如果知道某种性状与一定限制性片段连 锁,则可以判断后代中该性状的有无。

RFLP

产前诊断
对于某些先天性遗传疾病,严重影响人 的生活,可以通过RFLP的产前诊断避免 畸形儿或患病儿的出生。 从羊水细胞或绒毛膜细胞提取DNA,进 行酶切和电泳、与父母的RFLP进行比较 分析,确定。

亲子鉴定和犯罪证据
子女获得来自父母的特异性RFLP,通过 比较可以判定子女与成年人(父母)的 血缘关系。 RFLP的个体差异性,通过犯罪嫌疑人的 DNA与犯罪现场得到的样品DNA的比较, 从分子上提供确切的证据。

DNA证据

亲子鉴定

随机扩增多态性DNA (RAPD)
Random Amplified Polymorphism DNA 用较短的引物(10-30nt),将基因组 DNA进行扩增,经琼脂糖电泳分离,染 色或放射自显影显示多态性。

RAPD扩增结果

扩增片段长度多态性(AFLP)
Amplified Fragment Length Polymorphism DNA经双酶切后,形成分子量不等的随机 RF,用特定的接头连接在两端,通过引物 与接头序列的识别,经PCR扩增后,聚丙 烯酰胺电泳分离。形成特异的条带。

作业


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